戊型肝炎病毒IgA抗体的研究进展

戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的经消化道传播的急性传染病，发病率逐年升高，目前尚无特效 治疗 方法，也无特异性被动和主动免疫制剂可供预防。在急性戊型肝炎患者中，血液或粪便中HEV RNA持续时间较短，操作复杂、成本高，不能在临床广泛开展。HE的诊断主要依靠血清HEV抗体检测，抗-HEV IgM是HE急性感染的诊断指标之一，类风湿因子等的存在会影响血清IgM的检测，造成假阳性。抗-HEV IgG一般在发病2周后可检测到，可持续1年甚至数年，因此抗-HEV IgG不能鉴别患者为HEV急性感染还是既往感染。有研究表明抗-HEV IgA是HE的急性指标，可代替或辅助现有IgM诊断试剂用于HE诊断，既增加了检测特异性，又能有效减少漏诊。
HE是由HEV引起的经消化道传播的急性传染病，发病率逐年升高。有研究表明HEV还可通过血液途径传播[1]，而且最近发现HE在器官移植患者中可以慢性化[2]。HEV流行广泛，呈全球性分布，主要累及卫生条件差的亚洲、非洲和中美洲等地区中的 发展 中国 家，在西方发达国家也有散发病例报道，在未暴发HEV的地区人群可检测到抗HEV抗体。在某些发展中国家，HE占成人急性病毒性肝炎的50%以上，尽管只有1%～3%的患者发展为致死性急性肝炎，病死率为2.5％，明显高于甲型(0.1%)和乙型(0.9%)肝炎，孕妇感染后病死率可高达20%。我国曾发生11次HE的暴发或流行，是HE高发区之一，1986年至1988年新疆发生迄今为止规模最大的HE暴发性流行，约有12万人感染[3]。据卫生部发布的传染病疫情公示，近年来我国HE发病数呈现连续增长的态势，死亡率也在逐年增加，已经被列为因HE发病和死亡而引起的 经济 负担最为严重的国家之一。

　　HEV是一个近似球形的二十面体颗粒，表面有突起和刻缺，形似杯状，无包膜，平均直径为32～34 nm。HEV对高盐、氯化铯、氯仿等敏感，在70℃～80℃中易裂解，在液氮中稳定。HEV的基因组是一单股、正链RNA分子，全长约7.5 kb，由5′端非编码区(NCR)、非结构区(NSR)、结构区(SR)、3′端NCR和3′端Poly(A)尾巴组成，5′端NCR和3′端NCR之间为编码区，包含3个开放读码框(ORF1、ORF2和ORF3)。ORF1主要编码与HEV复制相关的非结构蛋白，包括甲基转移酶、蛋白酶、RNA解链酶及RNA聚合酶。ORF2编码病毒衣壳蛋白，为主要的结构基因编码区。ORF3位于ORF1和ORF2之间，与ORF1和ORF2有部分重叠，编码病毒特异性的免疫反应抗原。作为一种单链RNA病毒，HEV基因组与蛋白质容易发生变异，根据HEV核苷酸序列同源性比较的结果，目前至少可以将HEV分成4个主要的基因型和多个亚型。基因型1：包括3个亚型，分别以HEV缅甸株(1a型)、巴基斯坦株(1b型)和摩洛哥株(1c型)为代表，以往以中国新疆株为代表的中国HEV与巴基斯坦株属同一亚型；基因型2：以HEV墨西哥株为代表；基因型3：由美国株及大多数猪HEV组成；基因型4：包括新近发现的HEV中国株和 台湾 株[3-4]。ORF2蛋白在已发现的HEV基因型中最为保守，具有很强的免疫原性，其编码的氨基酸序列的同源性并不完全一致，第3型和第4型之间达94.6％，显示了在种系进化上3、4两型间的氨基酸序列相近，可能含有共同的抗原表位。第1型和第2型之间的氨基酸序列同源性达92.2％～92.8％。流行病学资料报道以往我国HE发病以1型毒株为主要病原体，近期的研究报告显示4型HEV是目前引起我国散发性HE的主要病毒株[4]。

　　HE是一种严重危害人类健康的全球性疾病，目前尚无特效治疗方法，也无特异性被动和主动免疫制剂可供预防。早期诊断，不仅对于患者的治疗和改善预后具有重要意义，还可以及早发现具有传染性的HE患者，准确评判HE急性感染、亚临床感染、既往感染，对临床处理及预后判断有重要意义。做到及早隔离传染源，防止病毒污染水源和食物，造成大规模暴发流行。

　 　1 HEV RNA、抗-HEV IgA、抗-HEV IgM和抗-HEV IgG与HE的关系

　　1.1 HEV RNA与HE的关系

　　HE潜伏期平均4～6周，在出现临床症状之前或同时即有粪便排毒和病毒血症，然后才出现肝损害，血清HEV抗体在起病前1周左右开始升高，HEV RNA在血清或粪便中出现较早，HEV RNA的检测是HE确诊的指标，但大多数患者的病毒血症持续时间较短，平均约为2周，病毒载量低，所以检出率较低，故RT-PCR法检测HEV RNA阴性的病例不能排除HE。鉴于PCR结果受标本采集时间的限制，而且PCR操作复杂、成本高、易受污染、会造成误诊或漏诊，因此不宜作为常规检测项目在临床广泛开展[5]。

　　1.2 抗-HEV IgM与HE的关系

　　目前HE的诊断主要依靠血清HEV抗体检测，抗-HEV IgM是HE急性感染的诊断指标之一[6-7]，在感染HEV第2周就可以在血清中被检测到，第6周达到高峰，随后迅速下降，阳性持续时间较短(3个月左右)。而且抗-HEV IgM现有诊断试剂常有漏诊和误诊。众所周知，类风湿因子等的存在会影响血清IgM的检测，造成假阳性，这在其他疾病检测中屡见不鲜，抗-HEV IgM检测也不例外[8-9]。而抗-HEV IgM检测也常常有假阴性报道，Nicand等[5]在抗-HEV IgM阴性的HE亚临床感染患者体内发现病毒血症和粪便排毒；Mitsui等[10]也报道在医疗工作人员系列血清追踪调查中，HE亚临床型感染患者出现短暂病毒血症，而IgM检测持续阴性；Gotanda等[11]报道了在谷丙转氨酶明显升高的献血员中，出现HEV病毒血症却无IgM反应性，等等。最近，Zhao等[9]又发现在11例HEV抗原阳性的HE患者血清中，抗-HEV IgM阴性。这部分漏诊的带毒者即成为HEV的移动传染源，有可能是造成HE区域性小规模流行和持续散发的原因。这说明现有的IgM诊断试剂尚不能满足HEV感染的临床诊断和流行病学筛查与防治的需要。

　　1.3 抗-HEV IgG与HE的关系

　　抗-HEV IgG一般在发病2周后可检测到，在第7周达到高峰，并能一直保持在较高的水平，至少可持续1年甚至数年，因此抗-HEV IgG不能鉴别患者为HEV急性感染还是既往感染[8,12]。有研究表明IgG抗体亲和力高低测定可诊断是否为急性感染。通常感染初期IgG亲和力低，恢复期IgG亲和力高，但重复感染患者通常也表现为IgG亲和力高。这种情况在孕妇弓型虫感染患者中也有报道。虽然抗体亲和力能用来区分感染时间，特别是亚临床和无黄疸的患者，也可以鉴定抗-HEV IgM阴性的急性感染，但高和低亲和力的区分不得不凭经验，而且不是所有急性感染都是抗-HEV IgG亲和力都低，也有的患者发病早期抗-HEV IgG阳性，而亲和力高，因此抗体亲和力实验只能作为一种验证实验[13]。

　　1.4 抗-HEV IgA与HE的关系

　　IgA作为免疫球蛋白中一个重要的成员，在黏膜免疫中起着重要的作用。认为可以作为外部屏障作用阻止病毒吸附到黏膜上皮细胞，同时拦截正在感染上皮细胞的病毒，并通过分泌作用将截获的病毒送回到上皮细胞外，已经证实在脊灰病毒、汉坦病毒等感染中，IgA发挥不容忽视的作用[14-15]。EBV-VCA-IgA的检测已被公认是鼻咽癌早期发现、早期诊断、预后监测及大规模普查的敏感、可靠、简便的方法，是提高鼻咽癌早期确诊率的有效途径[16]。IgA抗体被证实在一些病毒性疾病的急性感染期升高，可以作为早期诊断的标志。
在大部分HEV早期感染患者中，可检测到抗-HEV IgM和抗-HEV IgA阳性，但抗-HEV IgA阳性持续时间比抗-HEV IgM长，平均约为(120±23)d，对HEV感染的早期诊断更有意义[8]。早在1993年Chau等[17]就发现血清抗-HEV IgA与IgM同步升高，在恢复期消失，可以作为HEV急性期的感染指标。近年来越来越多的研究证实了这种观点[18-19]，IgA作为HEV急性诊断指标的研究越来越受到人们的重视。Takahashi等[20]在猪感染HEV的研究中发现，抗-HEV IgA与病毒血症的相关性远远高于抗-HEV IgM，提示抗-HEV IgA可以指示排毒。而且有些急性感染的患者没有ALT的升高，会有短期的病毒血症，抗-HEV IgG阳性，抗-HEV IgM阴性，却可以检测到抗-HEV IgA阳性，类似情况在脊髓灰质炎病毒、汉坦病毒引起的病例中也有过相关报道[14-15]。有研究表明抗-HEV IgA是HE的急性指标，可代替或辅助现有IgM诊断试剂用于HE诊断，既增加了检测特异性，又能有效减少漏诊[19-21]。2 抗-HEV IgA的检测方法

　　2.1 蛋白印迹试验检测抗-HEV IgA

　　有 文献 报道用蛋白印迹试验检测抗-HEV IgA[22]，这种方法具有灵敏度高、特异性好的特点，可用作HE患者的确证试验。但这种方法操作复杂，耗时较长，影响因素较多，不适合在临床上广泛开展。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗-HEV IgA的方法，具有灵敏、快速、操作简便、费用较低的优点，操作中可用较少的人力快速处理大批量血清标本，检测结果既可直接用肉眼定性判断，也可借助酶标仪精确定量读数，数据重复性好，结果客观可靠，还可借助全自动酶免分析仪使操作过程实现自动化、标准化，适合临床常规检测，是目前HE实验室辅助诊断方法的研究热点。
2.2 HEV IgA间接法ELISA

　　目前文献报道检测抗-HEV IgA多用间接法ELISA，其原理是将用已包被抗原与特异性IgM、IgG、IgA结合，由于患者血清中存在大量的抗-HEV IgG、抗-HEV IgM与抗-HEV IgA竞争结合位点，从而敏感性降低，须通过去除抗-HEV IgG和抗-HEV IgM来提高其敏感性[9]。同时因间接法所包被抗原采用基因1型或2型HEV重组蛋白或合成肽抗原，有研究表明，用第1、2基因型多肽做抗原对检测第3和4基因型感染患者的抗-HEV IgG、抗-HEV IgM和抗-HEV IgA时，其反应不敏感[23]。最近，Bendall等[13]研究发现，以HEV第1、2基因型抗原建立的ELISA诊断试剂在检测英国本土HEV第3基因型感染的患者血清时，急性期HEV抗体检出率可达95%，而半年后检出率仅为12%。Herremans等[22]则发现以HEV第1、2型抗原检测HEV第1型感染，检出率为100%，而检测第3基因型毒株感染时，检出率仅为67%(ELISA)和57%(immunoblot assay)。由于HEV具有多基因型的特征，不同基因型抗原和感染不同基因型HEV患者血清反应时会出现抗原抗体结合的差异，这是导致一些检测方法漏检的主要原因。因此建立高灵敏度和特异性的ELISA检测方法需要使用具有广泛反应性的抗原，尤其是对我国这样存在多基因型HEV感染的国家以及地区进行临床诊断和流行病学筛查[4]。

　 　3 抗-HEV IgA检测需要解决的问题

　　抗-HEV IgA抗体被证实在HEV急性感染期升高，可以作为早期诊断的标志，已经越来越被认可和重视。目前国内外还没有抗-HEV IgA诊断试剂盒正式上市，虽然检测抗-HEV IgA方法已经有了很大的进展，但还存在很多问题：①因各种检测方法采用的抗原不尽相同，因此敏感性差。最早对HEV的研究表明，HEV基因型按地理位置分布，一个地方只存在一种基因型，但是随着新的HEV毒株不断被发现，同一个地区可以存在两种及以上的基因型。随着与 经济 发展 相适应的全球人员流动性的增加以及HEV研究的深入，HEV基因型的地域分布特征已经并将继续发生重要改变。这种情况下，使用多基因型混合抗原建立酶联免疫检测方法，可以大大减少漏诊率。②因为抗IgA与IgA不同片段结合位点的差异，导致检测方法的敏感性也会有较大差异，选择与IgA反应性高的抗IgA单克隆抗体，可提高抗-HEV IgA检测的敏感性和特异性[17]。③IgA可以从黏膜中分泌，故如能取唾液进行检测，不仅方便而且减轻患者痛苦，值得进一步研究。④在免疫球蛋白缺乏症患者中，HEV近期感染者其抗-HEV IgA可能表现为阴性。⑤通过血液传播的患者可逃避黏膜免疫，IgA很低甚至没有。

　 　4 抗-HEV IgA检测前景展望

　　目前，对抗-HEV IgA的诊断价值也越来越重视，研制具有高特异性和敏感性的诊断试剂盒具有十分重要的意义。目前IgA类抗体检测方法除了蛋白印迹试验检测，间接法ELISA外，捕获法ELISA也有较好应用，如冠状病毒、脊髓灰质炎病毒等的IgA抗体的检测[14-24]。其原理是首先将高特异性的抗人IgA α链McAb包被于微孔板，专一地捕获血清中的IgA，不与IgM、IgG或其他种类的免疫球蛋白结合，然后抗原特异性IgA抗体与酶标抗原结合，再加入底物液显色。目前IgA捕获法ELISA在HEV抗体检测中还没有相关报道，但张兰芳等[25]已成功建立了基于多基因型HEV混合抗原的IgM抗体捕获法ELISA。该法与间接法ELISA相比，前者阴性本底很低，阴性和阳性结果区别更加明显，便于结果的判断，所用的酶标抗原是不同基因型和亚型混合抗原，抗原性稳定，共同抗原表位在不同基因型之间可诱发交叉中和反应，能检测出来源于不同国家和地区的血清标本，具有较为广泛的血清反应性，漏检的机会少，敏感性高。HEV IgM捕获法ELISA的建立及其他病毒IgA抗体捕获法ELISA的建立为HEV IgA捕获法ELISA的建立奠定了基础。

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